Pewarnaan Gram pada Bakteri

Halo, gaes.. pada postingan kali ini saya akan membahas mengenai pewarnaan Gram pada bakteri. Gimana sih caranya? Bakteri kok bisa diwarnai ya? Oke, langsung aja ya..
Oh yaa.. kalau kalian males baca.. boleh nonton langsung aja di link: https://www.youtube.com/channel/UCvqNF47YOW-NPoDmHHQbbKw

Apa itu pewarnaan Gram?

Pewarnaan Gram adalah teknik pewarnaan yang digunakan untuk membedakan dua kelompok besar bakteri berdasarkan konstituen penyusun dari dinding sel bakteri, yang mana dengan pewarnaan Gram dapat membedakan antara kelompok Gram positif dan Gram negatif. Warna yang digunakan dalam pewarnaan Gram adalah merah atau ungu/violet. Pada bakteri Gram positif terdapat lapisan peptidoglikan yang tebal pada dinding selnya yang akan menyerap warna violet dari kristal violet, sehingga bakteri Gram positif mempertahankan kristal violet tersebut. Lain halnya dengan bakteri Gram negatif yang memiliki dinding peptidoglikan yang lebih tipis, sehingga tidak dapat mempertahankan violet kristal selama proses penguraian warna tetapi akan menyerap pewarna lainnya, yaitu warna merah dari safranin.

Pewarnaan Gram melibatkan tiga proses, yaitu pewarnaan dengan pewarna yang larut dalam air, seperti kristal violet, dekolorisasi, dan pewarnaan ulang balik (counterstaining), biasanya dengan safranin. Perbedaan dalam ketebalan lapisan peptidoglikan dalam membran sel antara bakteri Gram positif dan Gram negatif, menyebabkan bakteri Gram positif akan mempertahankan warna ungu dari kristal violet selama proses dekolorisasi, sedangkan bakteri Gram negatif kehilangan warna ungu dari kristal violet dan sebaliknya Gram negatif akan menyerap warna merah dari safranin dalam proses pewarnaan akhir.

Sampel yang mengandung bakteri setelah diwarnai dengan pewarna kristal violet, selanjutnya ditambahkan larutan Gram yodium (yodium dan kalium iodida) agar terbentuk kompleks antara kristal violet dan yodium. Kompleks tersebut merupakan molekul yang lebih besar daripada pewarnaan kristal violet aslinya dan yodium bersifat tidak larut dalam air, sehingga mampu mempertahankan warna kristal violet dalam sel bakteri.

Dekolorisasi seperti penggunaan etil alkohol atau aseton ditambahkan ke sampel, hal tersebut berfungsu untuk mendehidrasi lapisan peptidoglikan, menyusut dan mengencangkannya. Kompleks kristal violet-yodium besar tidak mampu menembus lapisan peptidoglikan yang diperketat tersebut, dan akhirnya terperangkap dalam sel bakteri Gram positif. Sebaliknya, membran luar bakteri Gram negatif terdegradasi dan lapisan peptidoglikan yang lebih tipis dari sel negatif Gram tidak dapat mempertahankan kompleks kristal violet-yodium, sehingga menyebabkan warnanya ungu dari kristal violet hilang.

Counterstaining, seperti penggunaan safranin yang larut dalam air yang lemah, ditambahkan ke sampel tersebut, hingga terwarnai merah. Safranin yang lebih ringan daripada violet kristal, itu tidak mengganggu warna ungu dalam sel Gram positif tetapi, sel Gram negatif Gram yang tidak berwarna akibat dekolorisasi akan berwarna merah.

Prinsip Pewarnaan Gram pada Bakteri

Bakteri Gram Positif akan menyerap warna ungu dari kristal violet setelah proses dekolorisasi, sedangkan bakteri Gram negatif akan kehilangan warna ungu saat dekolorisasi dan akan menyerap warna merah dari safranin.

Alat dan Bahan

1.     Kristal violet

2.     Larutan yodium

3.     Etanol

4.     Safranin

5.     Aquades dalam botol semprot

6.     Object glass
7.   Mikroskop
8.   Bunsen

Prosedur Pewarnaan pada Bakteri Gram

1. Setetes atau 1 ose sampel yang mengandung bakteri dibuat preparat pada object glass, lalu diratakan.
2. Sampel tersebut difiksai (dipanaskan diatas api Bunsen dengan hati-hati dengan cara melewatkan preparat diatas api Bunsen 3 kali.
3. Kristal violet ditambahkan diatas preparat, lalu diinkubasi selama 1 menit.
4. Preparat dibilas dengan aliran aquades selama 5 detik secara perlahan untuk menghilangkan kristal violet yang tidak terikat dengan sel bakteri.
5. Larutan Gram yodium ditambahkan diatas preparat dan diinkubasi selama 1 menit.
6. Preparat dibilas dengan etanol selama ~ 3 detik dan dengan segera dibilas dengan aliran aquades secara perlahan. Alkohol akan menghilangkan warna ungu pada sampel jika itu adalah Gram negatif, tetapi jika alkohol tetap pada preparat terlalu lama, itu juga dapat menghilangkan pewarna kristal violet pada sel Gram positif.
7. Safranin ditambahkan diatas preparat lalu diinkubasi selama 1 menit.
8. Cuci dengan aliran aquades secara perlalahan selama maksimal 5 detik. Jika bakteri tersebut adalah Gram positif, ia akan mempertahankan pewarna kristal violet dan tidak menyerap pewarna safranin. Jika bakteri tersebut adalah Gram negatif, ia akan kehilangan pewarna kristal violet dan menyerap pewarna safranin.

• Preparat diamati menggunakan mikroskop pada perbesaran 400X sampai 1000X (menggunakan minyak imersi).

Interpretasi Hasil

Hasil Pewarnaan Gram pada Bakteri

Sel berwarna merah = (+) Bakteri Gram Positif 

Sel berwarna ungu = (+) Bakteri Gram Negatif